ゲノム・プロテオミクス

2014年1月21日 (火)

ポリアクリルアミドゲル電気泳動による血清及び尿蛋白の意義

http://www.jokoh.com/elp/lec/lec04/lec4.htm

第4回
特別講演
「ポリアクリルアミドゲル電気泳動による血清及び尿蛋白の意義」
東京医科歯科大学助教授 芝紀代子

1.はじめに

2.電気泳動の支持体

3.PAGEの分析方法
3-1 PAGの特徴
3-2 PAGとは
3-3 PAGの重合方法
3-4 PAGの濃度表示
3-5 スラブ(平板)電気泳動法
3-6 グラジエントゲル電気泳動法
3-7 ディスク電気泳動法
3-8 SDS-PAGEとは
3-9 SDS-PAG電気泳動法
3-10 分子量の測定
3-11 等電点電気泳動法
3-12 両性担体及びpIマーカー
3-13 二次元電気泳動法
3-14 タンパク染色剤
3-15 銀染色法
3-16 イムノブロッティング法

4.PAGEの臨床的有用性
4-1 ダブルアルブミン
4-2 アルコール性肝障害
4-3 リポ蛋白の分析
4-4 アルカリフォスファターゼアイソザイムの分析
4-5 ベーチェット病
4-6 尿蛋白の分析(1)
4-7 尿蛋白の分析(2)
4-8 唾液中の蛋白

タンパク質定量と染色

メモがわり。

GELSCAN 関連の情報です。

https://www.yodosha.co.jp/jikkenigaku/troubleshooting/quantitative_analysis/

羊土社

めざせ タンパク質定量と染色の達人

2011年4月12日 (火)

SYPRO Ruby キラー Lumitein

クリーンでエコな(酢酸やメタノール不要)タンパク質の電気泳動ゲル用の新しい蛍光染色試薬が発売されました。

テクニカルノートでは、
λ_ex=532nm
λ_em=610nm
とありますが、
励起(Excitaion:図中青)と蛍光(Emission:図中赤)スペクトルを見ると、

http://imeasure.cocolog-nifty.com/photos/fig/lumitein_ex_em_w360.png

ですので、GELSCANはバッチリ対応です。

どうやら、ライフテクノロジーズ社(米ABI社とInvitrogen社が合併)の

SYPRO Ruby キラーです。

日本では ナカライコスモバイオ和光純薬工業 等が販売しているようです

気になる価格ですが、比較すると倍の設定 ほぼ同じ価格です。

Lumitein 2.5 14.5万円/L
SYPRO Ruby 3.8〜6万円/L

(2004.4.19 Invitrogen社 ¥60,000/L)

(2005.12 PerkinElmer社 ¥38,000/L)

製造元 Biotium社リーフレット:

http://www.biotium.com/product/product_info/flyer/Lumitein.pdf

を見ると判りますが、ようするにプロトコルが簡略で
染色してから、スキャンするまでの時間を大幅に短縮できる、
ってのが売りのようです。

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2011年1月 4日 (火)

GELSCANの検出限界ODは4.0以上

GELSCANは、可視ゲルをスキャンすることが可能です。
フィルムスキャナと比較できるように、OD値を計測してみました。

■方法:
15段のステップタブレット(透過用)を2枚重ねして(%1)
OD:0.08〜5.75 までのステップ15段を用意。
GELSCANでスキャン。
スキャナ駆動ソフトウェア:iMeasureScan
ImageJで画像処理(%2)して、どの段まで見分けることができているかを調べる。

■結果:
シングルスキャンでは、OD:3.28
マルチスキャンでは、OD:4.06

http://imeasure.cocolog-nifty.com/photos/fig/gelscan_steptablet.png

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2010年11月 8日 (月)

一次元電気泳動解析ソフトウェア その3

新たな一次元電気泳動解析ソフトウェアを 弊社製品、電気泳動専用蛍光イメージスキャナGELSCANの販売代理店の1つ、ベルトールドジャパン株式会社より、2つ紹介してもらいました。

nonlinear社は、弊社でもオプション販売している、2次元電気泳動ソフト:
二次元電気泳動解析ソフトウェア Prodigy SameSpots
の製造元です。
デモ版を借りましたので、後ほど使用感を報告します。

GelQuantは、GUIと操作手順のみ見ました。
価格も安く、1次元のみであれば、ImageJでゲル用マクロを使うよりは簡単でした。

[5] TotalLab
製造元:nonlinear社
価格:¥220,000-

[6] GelQuant Express analysis software
価格:¥73,000-

※価格は、海外製品ですので為替相場によって予告無く変わる可能性があります。

■関連記事:
1次元電気泳動ゲル解析ソフトウェア
一次元電気泳動解析ソフトウェア その2

2010年4月20日 (火)

GelGreen (TM) 励起/蛍光スペクトル


http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/gene/article/GRGG.htm

和光純薬工業株式会社

2009年12月22日 (火)

一次元電気泳動解析ソフトウェア その2

電気泳動ゲル専用イメージスキャナ GELSCANにオプションにて添付する電気泳動解析ソフトウェアを調べています。

以前リストした製品について、カタログを入手し、価格、日本国内での営業の対応、技術サポート体制、そして製品の性能などの調査を始めました。

まず、Hulinksが扱っている BIOSOFT社製 QuantiScan についての情報です。

-----

製品名 QuantiScan

価格 ¥94,000-(税別)

製造元 BIOSOFT

日本代理店 ヒューリンクス

-----

BIOSOFT社は、スキャナ関連のソフトウェアとして UNGRAPHという製品もあります。論文等に掲載されたグラフを画像としてイメージスキャナでスキャンし、グラフの線をサンプリングしながら、表計算データにする変換するソフトウェアです。私も以前、ネット上でBIOSOFT社から直接($支払いクレジットカードにて)購入し、使っています。$300くらいでした。

〜〜〜〜〜 以下 ヒューリンクス社から公開許可を頂いた情報です。

■QuantiScan vs ImageJ

ご質問いただきました、ゲル電気泳動解析ソフト QuantiScan とImageJ との機能比較を簡単に行ってみましたのでご報告いたします。

大きな違いは、やはり、専用に設計・開発された商用ソフトウェアと、汎用的な画像解析ツールとして開発されたフリーウェアの違いということに収斂されると思います。

つまり、必要な事を比較的お手軽にできるというのが QuantiScan のアドバンテージです。例えば、この解析を業務として行う人には、レーンを簡単に検出し、ピーク検出やピークの高さ、面積の測定などほぼ自動的に行なってくれる QuantiScan にはメリットがあると思われます。

ただし、汎用の商用ソフトウェアであるだけに、それ以上の独自の解析手法を追加したり、特殊なファイル形式や特殊な画像を取り扱ったり等といったことは難しいという制約はあります。

QuantiScan のデモ版はおおよその機能をお試しいただけますので、弊社サイトからダウンロードしてお試しください。

https://www.hulinks.co.jp/download/demo/

以下、個別の機能について比較した内容を簡単に整理しました。
ご参考になりましたら幸いです。

▽レーン検出
どちらも矩形ツールを使って任意の矩形でレーンを指定することが可能です。これに加え等間隔の幅を持つ画像であれば、QuantiScan ではレーン数を指定すれば、半自等的に認識させることが可能です。

▽ピーク検出
QuantiScan では一つあるいは複数のレーンプロファイルから自動的にピークを検出することが可能です。ピークの高さ、面積等はほぼ自動的に計算処理させることができます。

ImageJ では基線と垂線を引いて明示的にユーザーが指定する必要があり、また、面積の計算は Magic wand を使って計算させることができますが、やはり基線を手動で指定する必要があります。

▽フィッティング
QuantiScan の自動ピーク検出機能には、多項式および Gaussianピークフィッティングがあります。

▽画像処理
ゲル電機泳動画像の解析に特化して開発された QuantiScan では、自動レーン検出や自動ピーク検出機能がありますが、それ以外には、画像処理の機能はありません。一方、汎用的な画像処理用に開発された ImageJ には多数機能がございます。

また、エッジ検出、コントラスト強化、ノイズ追加、フィルタ、FFT といった機能も同様です。

▽インポート
QuantiScan がインポートできるのはビットマップ、TIFF、JPEGファイルのみ。ImageJ は、プラグインやマクロを追加することでその他の様々なフォーマットのファイルをインポートが可能です。

以上、よろしくお願い申し上げます。

株式会社ヒューリンクス テクニカルサポート担当
http://www.hulinks.co.jp/support/

〜〜〜〜〜

2009年8月 5日 (水)

電気泳動ゲル撮影 SYBR Gold のサンプル画像を追加しました

http://imeasure.cocolog-nifty.com/photos/fig/sybr_gold_sample3_48bit_w400.png   http://imeasure.cocolog-nifty.com/photos/fig/sybr_gold_sample3_ginv_w400.png

(2009.9.4 追加)

-----

GELSCANのサンプル画像に
DNA蛍光染色:SYBR Goldの画像を追加しました。

http://imeasure.cocolog-nifty.com/photos/fig/sybr_gold_ij_w500.jpg

同じく、代表的なDNA染色:SYBR Greenの画像は下記をご覧下さい。

http://imeasure.cocolog-nifty.com/photos/fig/sybr_green_w500.png

SYBR Green(緑)とSYBR Gold(青)の励起/蛍光スペクトル

横軸:波長[nm]、縦軸相対感度、強度

Invitrogen - Molecular Probes - Spectra Viewerより。)

http://imeasure.cocolog-nifty.com/photos/fig/sybrgold_sybrgreen.png

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2009年7月28日 (火)

ゲル撮影装置 可視染色と蛍光染色の違い

電気泳動ゲルの染色方法としてタンパク質では、CBBが代表的です。
この検量線を作成して定量するためには、タンパク質濃度を算出する必要があります。
詳細は、
http://www.imeasure.co.jp/report/ImageJ_CBB.html
に記載してあります。
タンパク質の量を光の吸収で測定するため、
いわゆる光学的濃度に変換する必要があります。
O.D. = -1* LOG (T)
T:0~1.0
Tは透過率です。
こんなグラフになります。
横軸:透過率
縦軸:光学濃度
http://imeasure.cocolog-nifty.com/photos/fig/od_graph_.png

タンパク質濃度で、もっとも濃度の高いところでも
OD:0.5程度ですから、
計測では、凡そ、透過率で 0.3~1.0(30%~100%)を使うことになります。
検出限界濃度に近いところは、透過率100%に近いところとなります。

これが、検出限界近いところで、CBB染色での定量性が低くなる原因となっています。
つまり、
・ゲルについた水滴の有無
・ガラスの汚れ
・照明ムラ
などの要因のために、基準の透過率から変動を受けた時に、
そのまま検出限界に近いタンパク濃度値に影響します。
しかも一般的なフラットベッドスキャナでは、プラテンガラスの透明部分を透過率100%基準としているため、その管理をきちんと行わないとスキャン値の再現性が怪しくなります。

CBB染色したタンパク質電気泳動ゲルをイメージスキャナで得た画像:

http://www.imeasure.co.jp/report/ImageJ_CBB.files/image025.jpg

※水滴がそのまま画像に現れているのが見えます。

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ゲル撮影装置 25塩基単鎖DNAを1ピコモルまで計測しました

公開許可を頂いたので、過日、ゲル撮影装置 GELSCANで撮影したDNAの画像をアップします。
44塩基のDNAでは、0.3ピコモルまで検知できています。

■実験1:FITC修飾DNAの検出限界調査

http://imeasure.cocolog-nifty.com/photos/fig/fitc_1pmol_w500.png

スキャン条件:
電気泳動ゲル専用蛍光イメージスキャナ GELSCAN
解像度:300ppi (pixel per inch, 85μm)
イメージタイプ:16bitグレースケール

対象:
44塩基単鎖DNA
25塩基単鎖DNA
濃度:10, 6, 3, 1, 0.6, 0.3 [pmol]
3'末端FITC修飾

(染色しているのではなく、DNAの合成段階で化学的にDNAにFITCを結合。)

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