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2009年7月28日 (火)

ゲル撮影装置 可視染色と蛍光染色の違い

電気泳動ゲルの染色方法としてタンパク質では、CBBが代表的です。
この検量線を作成して定量するためには、タンパク質濃度を算出する必要があります。
詳細は、
http://www.imeasure.co.jp/report/ImageJ_CBB.html
に記載してあります。
タンパク質の量を光の吸収で測定するため、
いわゆる光学的濃度に変換する必要があります。
O.D. = -1* LOG (T)
T:0~1.0
Tは透過率です。
こんなグラフになります。
横軸:透過率
縦軸:光学濃度
http://imeasure.cocolog-nifty.com/photos/fig/od_graph_.png

タンパク質濃度で、もっとも濃度の高いところでも
OD:0.5程度ですから、
計測では、凡そ、透過率で 0.3~1.0(30%~100%)を使うことになります。
検出限界濃度に近いところは、透過率100%に近いところとなります。

これが、検出限界近いところで、CBB染色での定量性が低くなる原因となっています。
つまり、
・ゲルについた水滴の有無
・ガラスの汚れ
・照明ムラ
などの要因のために、基準の透過率から変動を受けた時に、
そのまま検出限界に近いタンパク濃度値に影響します。
しかも一般的なフラットベッドスキャナでは、プラテンガラスの透明部分を透過率100%基準としているため、その管理をきちんと行わないとスキャン値の再現性が怪しくなります。

CBB染色したタンパク質電気泳動ゲルをイメージスキャナで得た画像:

http://www.imeasure.co.jp/report/ImageJ_CBB.files/image025.jpg

※水滴がそのまま画像に現れているのが見えます。

一方、蛍光染色の場合は、
電気泳動ゲルのイメージャーの特性が「リニア」であれば、
蛍光強度がそのままタンパク質(DNAも同様)量に比例します。

(電気泳動ゲル専用イメージスキャナGELSCANでは、
 iMeasureScanと組み合わせることで、16bitリニアなデータを得ることができます。デジタルカメラは一般的に逆ガンマ2.2のかかった非可逆の8bitJPEG画像となっています。)

しかも、CBB染色では敏感に影響する、ゲルについた水滴の有無に影響されません。(プラテンガラスの内面から照射し、内面から撮像するため、プラテンガラスの上に載せたゲルの更にその上に有る水滴に影響を受けない。)

その結果、得られた画像の蛍光強度積分値がそのまま、タンパク量(もしくはDNA量)に比例した値となります。

このように蛍光染色の優れた点は、撮像の原理にも関係していると考えられます。

参考:

(1)ImageJによるCBB SDS-Page ゲルの検量線の作成

http://www.imeasure.co.jp/report/ImageJ_CBB.html

(2)SYPRO Ruby検量線の作成

http://www.imeasure.co.jp/pdf/GELSCAN_syproruby_imageJ.pdf

(3)ゲル撮影装置 25塩基単鎖DNAを1ピコモルまで計測しました

http://imeasure.cocolog-nifty.com/blog/2009/07/25dna1-7c85.html

(4)ゲル撮影装置【イルミネータ+カメラ方式】では満足できない方にお奨めしたい5つの理由

http://imeasure.cocolog-nifty.com/blog/2009/07/post-8bd9.html

(5)CBB染色したタンパク質電気泳動ゲルをイメージスキャナで得た画像

http://www.imeasure.co.jp/report/ImageJ_CBB.files/image025.jpg

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