CBBゲルのImageJによる解析 その２

■CBB染色　SDS-Page（一次元電気泳動ゲル）の検量線を作成してみました。
以下、URLをご覧下さい。

ImageJによるCBB SDS-Page ゲルの検量線の作成
http://www.imeasure.co.jp/report/ImageJ_CBB.html

ImageJを初めてお使いになる方に対し、確実に結果を出せるように１ステップ毎にスクリーンショットを撮った説明書です。ぜひお試しください。

また、2007.11.18時点では使いこなせなかった　ImageJの対数計算処理も含めてありますので、以下の２）〜６）の流れは省略可能です。

(以上　2009.2.1 追記)

■2次元電気泳動画像を解析する

2次元電気泳動ゲルのスポットを定量してみます。

http://imeasure.cocolog-nifty.com/blog/2007/11/cbb_34e9.html

流れは次のとおりです。

１）２次元電気泳動ゲルのデジタル画像から透過率データを得る

２）ImageJで画像を開きTextFileとして画像データを保存

３）Excelにてテキストファイルを読み込む

４）開いたExcelのワークシートをsheet1として、sheet２にOD値換算の演算ワークシートを作成する

５）Excelからテキストファイル形式でOD値のsheet2を保存する

６）ImageJにて開く

７）３Dプロットする

８）ImageJにてタンパク質濃度積分値を算出する

９）タンパク質の量（％od）を定量する

■詳細

１）２次元電気泳動ゲルのデジタル画像から透過率データを得る

　⇒　これは、GELSCANを使い、iMeasure Scanでガンマ１．０にして（Densitometor モード)16bit画像を得ます。

２）ImageJで画像を開きTextFileとして画像データを保存する

⇒ File / Save As / Text Image...

３）Excelにてテキストファイルを読み込む

⇒　データ/外部データの取りこみ/テキストファイルのインポート

４）開いたExcelのワークシートをsheet1として、sheet２にOD値換算の演算ワークシートを作成する

sheet2!A1　＝　-1 *LOG(sheet1!A1/(2^16-1))

５）Excelからテキストファイル形式でOD値のsheet2を保存する

６）ImageJにて開く

File/Import/TextImage..

７）３Dプロットする

※OD値データを再度開いた画像は見かけ上、スキャン画像を反転（白黒反転）しただけのように見えますが、３Dグラフ表示するとOD値となっています。また、Image/Typeでデータ構造を見ると32bitデータとなっています。32bitTＩＦＦ対応のPhotoshopで開くことも可能です。（％１）（2007.11.18修正）

８）ImageJにてタンパク質濃度積分値を算出する

ImageJにて　Analyze/Set Measurements

・Integrated Densityにチェック入れる

ImageJにて特に画像を選択せずに　Analyze/Measure

⇒これで画像全領域の濃度積分値が算出されます。

ImageJにて任意曲線ツールにて目的のスポットを囲む。Analyze/Measure

⇒これで注目スポットの濃度積分値が算出されます。

９）タンパク質の量（％od）を定量する

方法：OD値の総積算量に対して、それぞれのスポットのOD値積算量の割合を計算することで％odが算出できます

もっとも濃く大きなスポットは、

注目スポット１のタンパク質量（％odl）　＝　（１０５．８４３／５１２９．５２０）＊１００　＝２．０６［％od］

同様に、

注目スポット２のタンパク質量（％od）　＝　（４４．５２７／５１２９．５２０）＊１００　＝０．８７［％od］

％ｏｄから％ｖｏｌへの変換は調査中です（％２）。ちなみにネット上にはゲノムのＣＢＢ画像と各スポットの％ｏｄ、％ｖｏｌがさまざまなゲノムについて公開が始まっています。（％３）(2007.11.18修正）

以上

【注記】

（％１）32bitTＩＦＦ対応のPhotoshop（2007.11.18追記）

Adobe社のPhotoshopはダイナミックレンジの拡張を狙ってCS2(Version9相当）から32bitTIFF画像をひらけるようになりました。

ファイル／指定形式で開く／（ファイル名下の入力箇所）指定形式で開く：TIFF(*.TIF,*.TIFF)

ただし、Pixelの値を示す［情報]ダイアログでは8bit相当の表示しかありません。また、画像処理は、レベル補正は使用せず、露光量のみとなっています。

イメージ／色調補正／露光量

露光量とは、２の対数のスケールであり、+1EVは輝度を2倍にすること。-1EVは輝度を半分にすることに相当します。これらの行為は、ガンマ１．０の画像のレベル補正にて、+1EVは、ハイライトを半分の値にして明るくすることに相当します。

ダイアログには、ガンマもありますが、タンパク質量の相対量(%vol)を算出することが目的である場合、変更してはいけません。センサのリニアリティが崩れ、定量性が消失します。

（％２）OD値からタンパク質量を算出する－－－現在検証中。（2007.11.18追記）

（％３）カイコゲノムのＣＢＢ2次元電気泳動画像のデータベース　（2007.11.18追記）

http://kaiko2ddb.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/search_2DDB.cgi

この画像もエプソンのスキャナでＣＢＢをスキャンして％volを算出しています。

つくばのＫ先生によると、

「イメージスキャナは定量性が低いので％volは２倍以内で一致していれば同じスポットと判定している。」

「高価なイメージャーでは、％vol値にて１０％程度の精度で同じスポットであると判定している」

とのことでした。

はたして、ＧＥＬＳＣＡＮはどの程度の精度が出るのでしょうか。

実験は続きます。